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如何將光學(xué)顯微鏡變成奈米顯微鏡如何將光學(xué)顯微鏡變成奈米顯微鏡 發(fā)亮的分子越過了物理的屏障
然而，有一段很長的時間，光學(xué)顯微鏡被一個物理的屏障所阻礙，限制了所能解析的結(jié)構(gòu)大小。在1873年，顯微鏡學(xué)家恩斯特？阿貝發(fā)表了一個方程式，證明了光學(xué)顯微鏡的解析度是如何受到光的波長，以及一些其它的因素所限制。因此這導(dǎo)致科學(xué)家們，在二十世紀(jì)的大半時間里，相信光學(xué)顯微鏡是永遠(yuǎn)無法用來觀察那些比所用的光之波長的一半還小的物體，也就是0.2微米 (圖一)。細(xì)胞里一些胞器的輪廓，例如細(xì)胞的發(fā)電機(jī)粒線體，雖可以看到，但是幾乎不可能分辨更小的物體，因此譬如想要追蹤細(xì)胞里蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，就無法做到，這好比能看到一個城市的建筑物，但卻無法看出市民如何的生活，和如何為其生存而努力。為了了解一個細(xì)胞如何的運作，你必須能追蹤個別的分子如何的工作。
 圖解：圖一 在十九世紀(jì)末葉，恩斯特？阿貝定義了光學(xué)顯微鏡的解析度約為光波長的一半，差不多是0.2微米，這意味著科學(xué)家能夠區(qū)別一個完整的細(xì)胞以及一些細(xì)胞內(nèi)的胞器，不過他們將永遠(yuǎn)無法分辨小到如一個正常大小的病毒，或是一個單一的蛋白質(zhì)分子。
盡管阿貝的方程式依然成立，但繞射極限的障礙仍被克服了。艾瑞克？貝齊格，史蒂芬？海爾以及威廉？莫納等三人之所以獲得2014年的諾貝爾化學(xué)獎，就是因為他們利用螢光分子，將光學(xué)顯微鏡帶進(jìn)了另一個境界。理論上，不再存在有太小而無法觀察的結(jié)構(gòu)。就結(jié)果而言，光學(xué)顯微鏡變成了奈米顯微鏡。
如何規(guī)避阿貝繞射極限的故事，要分成兩條路線來說；兩個基于不同的原理所各自獨立發(fā)展出的方法，都獲得成功。讓我們回溯到1993年，在芬蘭西南部的一個學(xué)生公寓里，史蒂芬?海爾在翻閱一本量子光學(xué)的教科書時，得到了一個很棒的點子。
對阿貝繞射極限的青春叛逆面對的是懷疑
自從海爾在1990年從德國海德堡大學(xué)取得博士學(xué)位之后，他就一直在尋找方法，來規(guī)避阿貝在超過一個世紀(jì)以前所訂下的限制。挑戰(zhàn)一個已經(jīng)建立的理論，這樣的想法雖很誘人，但是在德國的資深科學(xué)家們，用懷疑面對了他的熱情，導(dǎo)致了海爾往寒冷的北方尋找庇護(hù)所。一位在芬蘭特爾庫大學(xué)研究螢光顯微鏡術(shù)的教授，給了海爾在其研究小組工作的一個職位。海爾相信一定有一個機(jī)會能夠克服阿貝的繞射極限，而當(dāng)他讀到那本量子光學(xué)課本里面“受激放射”的字語時，在他的腦海里浮現(xiàn)了一個新的想法：“在那個瞬間，曙光在我腦際出現(xiàn)，我終于找到一個實際的觀念來追求 ― 一條真正的線索。”這是他于2009年自己的說明 ― 讓我們進(jìn)入他的想法一探究竟。
解答：用一個奈米大小的手電筒掃描樣品
在特爾庫大學(xué)，海爾在進(jìn)行稱為螢光顯微鏡術(shù)的研究，那是一種利用螢光分子來讓細(xì)胞顯像的技術(shù)。舉例來說，他們可以使用只專一的與細(xì)胞的DNA偶合之螢光抗體，科學(xué)家們用一個短暫的脈沖光來激發(fā)抗體，這會讓抗體發(fā)亮并持續(xù)一個短暫的時間，如果抗體是與DNA偶合的，它們就會在細(xì)胞當(dāng)中放光，因為DNA是塞在細(xì)胞核里面的。利用這個方法，科學(xué)家們可以看到某些分子的位置，但是他們只能定出一群聚集在一起的分子之位置，例如一些糾纏在一起的多股DNA，但是因為解析度太低，而無法分辨單股的DNA，這就好像你可以看到一卷紗線，但卻無法看出紗線是如何纏繞的。
當(dāng)海爾讀到受激放射時，他體認(rèn)到應(yīng)該可以設(shè)計一種奈米的手電筒，能夠?qū)χ鴺悠芬砸淮我粋€奈米的方式掃描。利用受激放射，科學(xué)家們可以將分子的螢光淬滅，當(dāng)他們將一道雷射光束照在那些發(fā)光的的分子上時，它們會立刻的失去能量而變暗。在1994年，海爾發(fā)表了一篇論文概略說明了他的想法，他規(guī)劃的方法稱為受激放射消去法，利用一道脈沖光將所有的螢光分子激發(fā)，同時利用另一道脈沖光將所有的螢光分子淬滅，但是只有在中間的一個奈米尺度大小的體積之內(nèi)除外(圖二)，因此只會取得在這個體積之內(nèi)的螢光。透過對樣品的掃描以及同時對光線強(qiáng)度的測量，就可以取得一張清楚的圖像。每一次被容許放出螢光的體積愈小，最后得到的影像解析度就愈高，因此在理論上，光學(xué)顯微鏡在解析度方面就不再有限制了。
 在德國發(fā)展頭一個奈米手電筒
海爾的理論文章并未立刻的激起一場騷動，但是的確有趣到讓海爾在位于哥廷根的馬克斯？卜蘭克生物物理化學(xué)研究所，得到一個職位。在接下來的數(shù)年里，他讓自己的想法開花結(jié)果；他設(shè)計了一個STED顯微鏡，于2000年，已經(jīng)能夠展示真的可以實際的運用他的想法，其中之一是用來取得一張大腸桿菌的圖像，并具有用光學(xué)顯微鏡從來無法達(dá)到的解析度(圖三)。
 圖解：圖三 由史蒂芬？海爾透過STED顯微鏡，最先所取得的幾個圖像之一。在左邊是一個普通的光學(xué)顯微鏡取得的大腸桿菌圖像，在右邊則是同一個大腸桿菌，用STED顯微鏡照出的結(jié)果，其解析度高了三倍。此圖
STED顯微鏡從收集一大堆很小的體積所放出的光，然后集合成一張整體的圖像，相對的比較，另一種原理也得到了成功，那被稱為單分子顯微鏡術(shù)，需要將許多張圖像重疊在一起。艾瑞克？貝齊格與威廉？莫納各自獨立的，以不同的基礎(chǔ)觀念切入，促成這項技術(shù)的發(fā)展。這項技術(shù)的基礎(chǔ)，是在莫納成功的觀測到一個小的螢光分子時所奠定。
W. E. 莫納 ― 首先觀測到單一的螢光分子
在大部分的化學(xué)方法中，例如量測吸收和螢光，科學(xué)家們是同時觀察上百萬的分子，在這些實驗中所得到的結(jié)果，反映的只是一種典型平均化的分子表現(xiàn)，但科學(xué)家們不得不接受這種困境，因為沒有別的可能性。不過有很長的一段時間，他們夢想著能夠量測每一個單一的分子，因為有愈豐富愈詳盡的資訊，就愈可能去了解譬如疾病是如何的發(fā)展。
在1989年，莫納成為全球第一位科學(xué)家能夠量測單一分子對光的吸收，那是一項具有關(guān)鍵性的成就。當(dāng)時他正在位于美國加州圣荷西的IBM研究中心工作，那個實驗打開了一扇通往新未來的大門，并且啟發(fā)了許多化學(xué)家將注意力轉(zhuǎn)移到單分子的身上，其中之一就是艾瑞克？貝齊格，接著會在稍后說明他的成就。
八年之后，莫納朝單分子顯微鏡邁出了第二步，那是運用之前諾貝爾獎在2008年所表彰過的綠色螢光蛋白質(zhì)。
分子大小的燈一開一關(guān)
在1997年，莫納進(jìn)入了在加州大學(xué)的圣地牙哥分校，那正是后來獲得諾貝爾桂冠的錢永健所在的學(xué)校，當(dāng)時錢永健正嘗試要讓GFP放出像彩虹般的各種螢光。這個綠色螢光蛋白質(zhì)是從一種螢光水母身上分離出來的，它的好處在于能讓細(xì)胞里面的其它蛋白質(zhì)顯像?？茖W(xué)家們先利用基因科技，將綠色螢光蛋白質(zhì)偶合到其它的蛋白質(zhì)上，那綠色的螢光就會暴露出這個被標(biāo)記的蛋白質(zhì)位在何處。
莫納發(fā)現(xiàn)有一種GFP可隨意點亮或關(guān)掉，當(dāng)他用488奈米波長的光去激發(fā)蛋白質(zhì)的時候，蛋白質(zhì)就開始發(fā)出螢光，但一個短暫的時間之后就會熄滅，在這之后無論他再用多強(qiáng)的光去照射這個蛋白質(zhì)，它也不會發(fā)光，不過他后來發(fā)現(xiàn)當(dāng)光的波長改為405奈米時，這個蛋白質(zhì)就會恢復(fù)生機(jī)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)重新活化后，它又會放出488奈米波長的螢光。
莫納將這些可被激發(fā)的蛋白質(zhì)均勻的散布在一個膠質(zhì)內(nèi)，讓每個蛋白質(zhì)之間的距離大于0.2微米的阿貝繞射極限，因為它們稀疏的散開來，一個普通的光學(xué)顯微鏡鏡就可以區(qū)辨每一個發(fā)亮的分子 ― 它們就好像一堆具有開關(guān)的小燈泡，這項結(jié)果發(fā)表在1997年的“自然”期刊上。透過這個發(fā)現(xiàn)，莫納展示了可以透過光學(xué)的方式，控制單一分子們的螢光，這解決了一個貝齊格在兩年之前所想到的問題。
對學(xué)術(shù)感到疲乏 ― 但仍為阿貝的繞射極限而著迷
與海爾一樣，貝齊格也為了越過阿貝繞射極限的想法而著迷。在1990年代初期，他正在美國紐澤西州的貝爾實驗室，研究一種新的光學(xué)顯微鏡術(shù)，稱為近場顯微鏡術(shù)。在此法中，光線是從一個非常薄的尖端所釋出，這個尖端與樣品之間的距離只有幾個奈米，雖然這種顯微鏡術(shù)也可以克服阿貝繞射極限，但是此法具有一些主要的弱點，舉例來說，因為放出的光范圍太短，以至于無法看到細(xì)胞表面之下的結(jié)構(gòu)。
貝齊格在1995年得到一個結(jié)論，那就是近場顯微鏡術(shù)無法更進(jìn)一步的改善，此外他在學(xué)術(shù)界感覺不太自在，因此決定結(jié)束他的研究生涯；即便不知下一步要何去何從，他毅然辭職，但是阿貝繞射極限仍在他的心中。步行在一個寒冷的冬天里，他想到了一個新的點子；是否可能用具有不同性質(zhì)的分子，那些發(fā)出不同顏色之螢光的分子，來克服阿貝繞射極限？
貝齊格已經(jīng)能用近場顯微鏡術(shù)觀測到單分子的螢光，與許多人一樣，貝齊格受到莫納的啟發(fā)，他開始仔細(xì)考慮，如果使用幾種會放出不同螢光的分子，例如紅色、黃色和綠色，是否可以利用普通的光學(xué)顯微鏡得到相同的解析度。他的點子是讓顯微鏡每一次用不同顏色的光來記錄影像，如果同一種顏色的分子都是均勻的散布，而且相互之間的距離大于阿貝繞射極限的規(guī)范，它們的位置將可精確的決定。接著當(dāng)這些影像重疊起來時，完整的圖像將具有遠(yuǎn)超過阿貝繞射極限的解析度，紅色、黃色和綠色的分子雖然相互的距離只不過幾個奈米，但仍能區(qū)別，如此就能克服阿貝繞射極限。不過，仍有一些實際的困難，例如缺乏那些具有不同光學(xué)性質(zhì)之分子，其差異要大到足以相互區(qū)別。在1995年，貝齊格在 Optical Letters 這份期刊上發(fā)表了上述想法之理論，隨即離開了學(xué)術(shù)界，并進(jìn)入了他父親開的公司。
被綠色螢光蛋白質(zhì)引誘回到顯微鏡術(shù)
貝齊格完全的脫離學(xué)術(shù)界，已經(jīng)有許多年了，但是有一天，一個對科學(xué)的渴望突然又復(fù)蘇了?；仡櫩茖W(xué)文獻(xiàn)時，他第一次看到綠色螢光蛋白質(zhì)的論文，體認(rèn)到有一個蛋白質(zhì)，能讓其它的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)顯像，活化了貝齊格對如何克服阿貝繞射極限的想法。
真正的突破發(fā)生在2005年，當(dāng)時他偶然發(fā)現(xiàn)到那種可以隨意活化的螢光蛋白質(zhì)，很類似那些莫納在1997年，于單分子的層次所觀察到的螢光蛋白質(zhì)。貝齊格知道，這個分子正是可以實現(xiàn)他在十年前所想到的那個主意，所需要的工具。這種螢光分子并不需要具有不同的顏色，它們還是可以在不同的時間發(fā)出螢光。
藉著影像的重疊超越阿貝繞射極限
只不過一年之后，與研究可激發(fā)螢光蛋白質(zhì)的科學(xué)家合作，貝齊格展示了他的想法的確可以付諸實現(xiàn)。在一些例子當(dāng)中，他們將會發(fā)光的蛋白質(zhì)接在溶體的膜上面，溶體是細(xì)胞里的回收站，現(xiàn)在用一道脈沖光來激發(fā)出蛋白質(zhì)的螢光，因為使用的脈沖很弱，所以只能讓部分的分子開始發(fā)出螢光，由于它們的數(shù)目很少，幾乎所有發(fā)光分子之間的距離均大于0.2微米的阿貝繞射極限，因此每一個發(fā)光的蛋白質(zhì)之位置都可以在顯微鏡下記錄。一會兒之后，當(dāng)螢光消失時，他們重新激發(fā)另一組蛋白質(zhì)，同樣的，使用的脈沖弱到只能讓部分的分子發(fā)出螢光，同時這一組圖像被記錄下來，這個步驟一直不斷的重復(fù)。
 當(dāng)貝齊格將所有的影像重疊起來時，得到了一張溶體膜的超高解析圖像，它的解析度遠(yuǎn)遠(yuǎn)的超過了阿貝繞射極限。接著，貝齊格將這一份開創(chuàng)性的工作，于2006年發(fā)表在《科學(xué)》期刊上。
 圖解：圖五中間的圖是溶體膜的圖像，這是貝齊格用單分子顯微鏡，最初所取得的幾個圖像之一。在左邊是相同的圖，但是用傳統(tǒng)的顯微鏡所取得的。在右邊則是將膜的圖像放大，請注意此圖的尺度是0.2微米，等同于阿貝繞射極限，其解析度改進(jìn)了許多倍。
這幾位得獎?wù)呷云髨D在描繪生命最深層的奧秘
這些由艾瑞克？貝齊格，史蒂芬？海爾以及威廉？莫納等三人所開發(fā)的方法，發(fā)展出了幾個現(xiàn)在為全世界各地所使用的奈米顯微鏡技術(shù)。這三位得獎?wù)呷匀换钴S在這個不僅龐大，而且一直在增長的科學(xué)社群中，將創(chuàng)新的矛頭對著奈米顯微鏡術(shù)的領(lǐng)域，當(dāng)他們將功能強(qiáng)大的奈米顯微鏡瞄準(zhǔn)在生命中最小的零件時，他們也同時取得了最尖端的知識。史蒂芬？海爾為了對腦突觸有更好的了解，窺探了活的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部；威廉？莫納研究了與杭丁頓氏癥(舞蹈癥)有關(guān)的蛋白質(zhì)；艾瑞克？貝齊格追蹤了在胚胎中細(xì)胞的分裂，這些只是眾多例子當(dāng)中的幾個。有一件事情是肯定的，2014年的諾貝爾化學(xué)桂冠得主們，對發(fā)展人類最重要的知識，已經(jīng)奠定了基石。
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